空斑形成細(xì)胞測定（瓊脂固相法）檢測

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空斑形成細(xì)胞測定（瓊脂固相法）檢測概述

空斑形成細(xì)胞測定（Plaque Forming Cell Assay, PFC）是免疫學(xué)研究中用于評估B淋巴細(xì)胞功能和體液免疫應(yīng)答的重要技術(shù)。瓊脂固相法作為經(jīng)典的空斑形成細(xì)胞檢測方法，通過將淋巴細(xì)胞與抗原致敏的紅細(xì)胞（如綿羊紅細(xì)胞）混合后包埋在瓊脂凝膠中，利用補體介導(dǎo)的溶血反應(yīng)形成可見的空斑，從而量化抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量。該方法廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)、免疫調(diào)節(jié)劑篩選、疾病模型研究及免疫功能評價等領(lǐng)域，具有靈敏度高、結(jié)果直觀、重復(fù)性好等優(yōu)勢。

檢測項目

瓊脂固相法主要檢測以下核心項目：
1. 抗體分泌細(xì)胞數(shù)量：通過空斑計數(shù)反映特異性B細(xì)胞的活性與增殖能力；
2. 體液免疫應(yīng)答強度：評估抗原刺激后免疫系統(tǒng)的反應(yīng)水平；
3. 抗體類型分析：通過調(diào)整補體來源或檢測條件，區(qū)分IgM或IgG類抗體的分泌情況；
4. 細(xì)胞功能驗證：用于雜交瘤細(xì)胞株篩選或免疫治療細(xì)胞產(chǎn)品的效價測定。

檢測儀器

實驗需配備以下關(guān)鍵儀器設(shè)備：
- CO?培養(yǎng)箱：維持37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境；
- 倒置顯微鏡：用于空斑觀察與計數(shù)；
- 離心機：處理細(xì)胞懸液與分離淋巴細(xì)胞；
- 酶標(biāo)儀（可選）：定量檢測溶血釋放的血紅蛋白；
- 細(xì)胞計數(shù)儀：精確計算細(xì)胞濃度。

檢測方法

標(biāo)準(zhǔn)操作流程分為以下步驟：
1. 樣本制備：從小鼠脾臟或外周血中分離淋巴細(xì)胞，密度梯度離心法純化；
2. 瓊脂糖凝膠制備：將0.5%瓊脂糖與細(xì)胞懸液混合，鋪于培養(yǎng)皿形成固相基質(zhì)；
3. 補體添加：加入豚鼠補體溶液，37℃孵育1-2小時誘導(dǎo)溶血反應(yīng)；
4. 空斑觀察：顯微鏡下計數(shù)透明溶血斑，每個空斑代表一個抗體分泌細(xì)胞；
5. 數(shù)據(jù)分析：按公式PFC/10? cells計算單位細(xì)胞活性。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

實驗需遵循以下標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范：
- 標(biāo)準(zhǔn)：參照WHO《疫苗臨床前評價指南》中免疫原性檢測要求；
- 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：執(zhí)行《中國藥典》細(xì)胞免疫檢測相關(guān)章節(jié)規(guī)定；
- 質(zhì)量控制：空斑直徑需≥0.1mm，陰性對照空斑數(shù)應(yīng)＜5個/10?細(xì)胞；
- 方法驗證：批內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤15%，批間CV≤20%。

注意事項

確保檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵控制點包括：
- 補體需新鮮配制并預(yù)冷保存，避免反復(fù)凍融；
- 瓊脂糖濃度嚴(yán)格控制在0.5%-0.7%，保證凝膠通透性；
- 細(xì)胞接種密度需優(yōu)化，過高會導(dǎo)致空斑重疊；
- 需設(shè)置空白對照（無補體）和陰性對照（未免疫動物樣本）。